VIII Simposio Internacional de Química y Ciencias Farmacéuticas

SICF

VIII Simposio “Diseño, Obtención y Desarrollo de Fármacos”

Estudios de condiciones de reacción para establecer un procedimiento de conjugación del polisacárido capsular Streptococcus pneumoniae serotipo 22F

Resumen

En el Instituto Finlay de Vacunas se desarrollan vacunas conjugadas antineumocócicas. Hasta ahora, once serotipos han sido desarrollados. El 22F, asociado al fenómeno de remplazo, es epidemiológicamente relevante. Ahora se investiga en un procedimiento para la conjugación de su polisacárido capsular. Este está compuesto por unidades de pentasacárido con una glucosa lateral y un grupo O-acetilo, potencialmente relevantes para su antigenicidad. En este trabajo se estudian condiciones de cada etapa de reacción, prestando cuidado a la conservación del antígeno, para obtener conjugados inmunogénicos. Para esto, se empleo una metodología general basada en la fragmentación del polisacárido, la oxidación con peryodato y la conjugación a toxoide diftérico mediante aminación-reductiva. La SEC-HPLC de los fragmentos mostró que en 2-3h de hidrólisis con TFA se alcanzó el rango de trabajo de KD. Para la activación se determinó 2mM como concentración de peryodato que se ajusta a obtener el rango de oxidación de trabajo. Se observó fragmentación inespecífica pero esta se minimizó ajustando temperatura y tampón. Se corroboró la preservación de los grupos O-acetilos mediante ensayo de Hestrin y RMN-1H. Así se conservó la antigenicidad en todo el rango de trabajo de KD y nivel de oxidación. Se determinó que aumentando la concentración de polisacárido y la relación carbohidrato-proteína se favoreció la conjugación. Fragmentos con KD de 0.47 y 0.61 se conjugaron efectivamente a toxoide diftérico. Estos resultaron inmunogénicos en ratones BALB/c. En conclusiones, se alcanzaron condiciones de reacción para establecer un procedimiento de conjugación que asegura la obtención de conjugados inmunogénicos.

Abstract

Finlay Vaccines Institute has a project for developing pneumococcal conjugates vaccines. In these, serotype-specific capsular polysaccharides are covalently linked to an immunogenic protein. So far, conjugation procedures for eleven serotypes have been developed. The 22F is epidemiologically relevant, been associated in some studies with serotype replacement. Now, a procedure for its capsular polysaccharide is under investigation. This is composed of repetitive units of a pentasaccharide decorated with a lateral glucose and an O-acetyl group potentially relevant for antigenicity. In this work we study reaction conditions of each step paying special attention to antigen conservation to obtain immunogenic conjugates. For this, a general methodology based in the fragmentation of the polysaccharide, periodate oxidation and conjugation to diphtheria toxoid via reductive-amination is used. Fragments evaluation by SEC-HPLC showed that KD work rank of 0.45-0.60 was reached 2-3 h of hydrolysis with TFA. For activation, it was determined that a periodate concentration of 2 mM best fit oxidation level work rank. Unspecific fragmentation occurred but this was minimized working with the tuning of temperature and buffer. Hetrin assay and 1H-NMR corroborated O-acetyl conservation after both reactions. Thus antigenicity was conserved all along the work ranks of KD and oxidation levels. It was determined that increasing carbohydrate concentrations and polysaccharide-protein ratio favored conjugation. Fragments with KD of 0.47 and 0.61 were effectively conjugated to diphtheria toxoid. These resulted immunogenic in BALB/c mice model. In conclusion, it was reached reaction conditions to establish a conjugation procedure that assure obtaining immunogenic conjugates.