Introducción: La muteína no alfa de IL-2 (mutIL-2) es una variante de la interleucina-2 (IL-2) humana con la capacidad de estimular a las principales células efectoras de la respuesta antitumoral sensibles a la IL-2. Esta es la base del ensayo colorimétrico de proliferación de la línea celular murina CTLL-2, ampliamente extendido para la determinación de la actividad biológica in vitro de la IL-2 comercial, así como para otras citocinas de la familia. Debido a la fase de desarrollo en la que se encuentra el producto, se hace necesario un método robusto y fiable para la medición de este atributo de calidad. Objetivo: Validar el método de actividad biológica in vitro de la muteína no alfa de IL-2 por proliferación celular de la línea CTLL-2. Materiales y Métodos: Este ensayo reporta la potencia relativa de la mutIL-2 mediante la incubación de la línea celular con diferentes concentraciones de la molécula. Se evaluó la robustez del método, su especificidad, linealidad, exactitud, precisión y rango. Resultados: El ensayo es robusto y específico para la conformación activa de la molécula y no hay interferencias con los componentes de la matriz. Se demostró que el método es lineal con un coeficiente de correlación de r=0,99. En el estudio de recobrado se obtuvieron valores entre 74 y 126% en un rango estimado entre 50% y 200%. El ensayo presentó una variabilidad intra e inter-ensayo menor del 10%. Conclusiones: El método es robusto, específico, lineal, exacto y preciso en el rango de 50% a 200%.