El presente trabajo tiene por objetivo determinar la caracterización cultural, morfológica y fisiológica in vitro, del hongo Fusarium spp., agente causal de la marchitez vascular de pitahaya amarilla (Hylocereus spp), en la Región Amazónica del Ecuador. Se recolectaron raíces de 8 fincas de producción de pitahaya amarilla ubicadas en el cantón Palora de la provincia de Morona Santiago. Se realizaron aislamientos que fueron evaluados e identificados mediante caracterización cultural (velocidad de crecimiento, color de micelio, color de reverso de la caja de Petri del aislado, borde y textura) morfológica (tamaño de microconidias, macroconidios y clamidosporas) y fisiológicas (Influencia de pH en el crecimiento micelial), con la finalidad de contar con un banco de aislados monospóricos para el control biológico en futuras investigaciones. Los experimentos se realizaron en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Estatal Amazónica. Para los ensayos se utilizaron medios de cultivo semi sólido (PDA y CLA) y medio de cultivo líquido PDB. La velocidad de crecimiento radial fue de 2,8 mm.día-1 de los aislados, independientemente de su procedencia. No se encontraron diferencias significativas en la caracterización cultural en cuanto al borde y textura de las colonias entre los aislados. Se detectaron variaciones en su coloración, observándose colores rojos, rojo pálido, rojo amarillento hasta el rosa claro. No se observaron diferencias significativas en cuanto al tamaño de microconidias, macroconidios y conidióforos, determinándose que el pH 7 es el óptimo para el desarrollo de Fusarium spp.