Executive Secretary

IX International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences

SIQF 2025

9th Symposium “Design, production and development of drugs” and 4th International Symposium “Chemistry of natural products”

Development of a method for serotype specific quantificaction of polysaccharide in vaccines by HPLC

Problem: Size Exclusion Chromatography coupled to fluorescence detection (HPSEC-FLD) is a technique used for the fluorochrome-assisted separation and quantification of biomolecules, due to its high sensitivity and selectivity. The quantification by HPSEC-FLD represents a simpler, more robust and versatile alternative to traditional immunochemical methods.
Methodology: During the development were used capsular polysaccharides of serotypes 1 and 5 of S. pneumonia (PsC1 and PsC5), monoclonal antibodies (MAb antiPsC1 and MAb antiPsC5 ), and fluorescein isothiocyanate fluorochrome (FITC). The method developed was based on specific antigen-antibody (Ag-Ac) interaction and the formed complex was evaluated by HPSEC-FLD. Prior to complex formation, the MAb was labeled with FITC. For the analysis, a TSK GMPW column (7.5 x 600 mm, 17µm) was used at a flow rate of 0.6 mL/min and detection was performed at Fluorochrome Excitation/Emission wavelengths (495/519 nm) on a Shimadzu chromatographic system, Nexera^® Series. All compounds were characterized by a SEC-MALS chromatographic system equipped with a Knauer/Azura assistant, UV detector, a Wyatt Technology Corp. model DAWN^® laser photometer with 18 light scattering detectors and an Optilab^® model differential refractive index detector. Additionally, the unconjugated and FITC-conjugated AcM was evaluated by an ELISA technique.
Results and Discussion: Calibration curves were designed by integrating the area under the curve of the complex formed for each serotype studied, establishing a linear fluorescence response against polysaccharide concentrations in a range from 0.010 to 0.200 µg/mL with adjusted R-square values ≥ 0.9800. The achieved curve was evaluated by quantifying the polysaccharide content in different samples.
Conclusion: The proposed technique permitted the quantification of the content of two S. pneumonia capsular polysaccharides through the combination of chromatographic techniques and fluorescence detection.

Problemática: La cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a la detección por fluorescencia (HPSEC-FLD) es una técnica que se utiliza para la separación y cuantificación de biomoléculas asistida con fluorocromos, debido a la alta sensibilidad y selectividad que esta presenta.
Objetivo: La cuantificación por HPSEC-FLD representa una alternativa más sencilla, robusta y de versátil funcionamiento a los métodos inmunoquímicos tradicionales.
Metodología: Se utilizaron anticuerpos monoclonales (AcM), polisacáridos capsulares (PsC) de los serotipos 1 y 5 de S. pneumoniae, y el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC). El método desarrollado se basó en la interacción específica antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) y el complejo formado se evaluó por HPSEC-FLD. Previamente a la formación del complejo, el AcM fue conjugado con FITC. En el análisis, se empleó una columna TSK GMPW (7,5 x 600 mm, 17µm) a un flujo de 0,6 mL/min y la detección se realizó a las longitudes de onda de Excitación/Emisión del fluorocromo (495/519nm) en un sistema cromatográfico Shimadzu, Serie Nexera^®. Todos los compuestos fueron caracterizados por un sistema cromatográfico SEC-MALS equipado con un asistente Knauer/Azura, detector UV, un fotómetro láser Wyatt Technology Corp. modelo DAWN^® de 18 detectores de dispersión de la luz y un detector de índice de refracción diferencial modelo Optilab^®. La columna de trabajo fue la misma que la evaluada en el sistema Shimadzu. Adicionalmente el AcM sin conjugar y conjugado al FITC fue evaluado por un sistema ELISA.
Resultados y Discusión: Se diseñaron curvas de calibración integrando el área bajo la curva del complejo formado para cada serotipo estudiado, estableciendo una respuesta lineal de fluorescencia contra las concentraciones de polisacárido (0,010-0,200 µg/mL) con valores de R² ≥ 0,9800. La curva fue retada cuantificando el contenido de polisacáridos en diferentes muestras.
Conclusión: La técnica propuesta permitió cuantificar el contenido de los dos polisacáridos a través de la combinación de técnicas cromatográficas y la detección por fluorescencia.