Trabajos previos establecieron un protocolo para la crioconservación de semillas de Nicotiana tabacum L. cultivar Sancti Spíritus 96. Sin embargo, se desconoce si este procedimiento tiene implicaciones a nivel fenotípico y molecular. Semillas de este cultivar colectadas a los 35 días después de la antesis y desecadas hasta contenido de agua de 2,1 %, se conservaron a 5 ºC o en nitrógeno líquido (-196 ºC). Transcurrido un año, se recuperaron, se sembraron en semillero de bandejas flotantes y se evaluaron morfológicamente tanto a los 20, 30 y 40 días después de sembradas como en fase de campo. Además, en fase de semillero se calcularon tres índices de crecimiento a partir de la dinámica entre los 20 y 40 días. No se observaron diferencias morfológicas tanto en fase de semillero como en fase de campo. Asimismo, al evaluar los índices de crecimiento no se apreciaron diferencias significativas entre ambos tratamientos. Para evaluar la fidelidad genética de las plántulas regeneradas a partir de semillas crioconservadas, se compararon sus patrones RAPD con los de plántulas obtenidas a partir de semillas conservadas a 5 ºC. No se encontraron bandas polimórficas al comparar las plantas derivadas de cada tratamiento. Así, el protocolo de crioconservación establecido no provocó diferencias visibles a nivel fenotípico en los caracteres estudiados entre las plantas derivadas de semillas crioconservadas y no crioconservadas. Además, no se detectaron cambios en la secuencia de ADN.