Problemática: El Zanthoxylum pistaciifolium Griseb es un árbol endémico de Cuba, utilizado en el tratamiento de infecciones pulmonares y el catarro común. Los reportes previos de la especie son limitados, aunque se describe la presencia de alcaloides, coumarinas y terpenoides. Recientemente se demostró la actividad anti-Trypanosoma cruzi del extracto de n-hexano–2-butanona de las hojas y su constituyente la eskimmianina; pero se desconocen otros metabolitos activos. Objetivo(s): Caracterizar el extracto de n-hexano–2-butanona y evaluar la actividad antimicrobiana de sus constituyentes. Metodología: La Cromatografía Líquida de Alta Resolución Semipreparativa acoplada a Detector de Arreglo de Diodos y Espectrometría de Masas (EM) se aplicó para el aislamiento de los compuestos puros. La espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear 1D y 2D y la EM se emplearon para la elucidación estructural. La actividad antimicrobiana, antiprotozoaria y citotóxica se evalúo por el método de microdilución in vitro con resazurina. Resultados y discusión: Se identificaron tres flavonoides: 3-O-metiléter-kaemferol (1), y dos compuestos nuevos; 3-metil-O-kaemferol-5-O-β-D-glucopiranósido (2) y 4',8-dihidroxi-3,7-dimetoxi-flavona-5-O-β-D-glucopiranósido (3). El compuesto 1 mostró una actividad débil a moderada frente a Trypanosoma cruzi (IC50 30,8 μM), Trypanosoma brucei (IC50 15,4 μM) and Plasmodium falciparum (IC50 53,8 μM), pero también mostró citotoxicidad frente a fibroblastos de pulmón humano (CC50 19,0 μM). Los compuestos 2 and 3 no mostraron actividad (IC50 and CC50 > 64 μM). Conclusiones: Este constituye el primer reporte sobre la identificación de flavonoides en el Z. pistaciifolium. Las evidencias científicas revelan las potencialidades de la especie como fuente de metabolitos antiprotozoarios.