VIII Simposio Internacional de Química y Ciencias Farmacéuticas

VIII Conferencia "Ciencias Químicas"

Dos variantes recombinantes de CogiTx1, un nuevo inhibidor de subtilisina tipo defensina aislado de la anémona marina C. gigantea

Resumen

CogiTx1 es un inhibidor de subtilisina tipo defensina, aislado de la anémona marina C. gigantea y es necesario completar su caracterizacion funcional. Sin embargo, la purificación de esta molécula a partir de la fuente natural presenta bajo rendimiento por lo que se necesita una fuente de proteína. El objetivo de este trabajo es obtener dos variantes recombinantes de CogiTx1. La secuencia de las variantes de CogiTx1 fue optimizada para su expresión en E. coli, incluyendo un sitio para la proteasa TEV, e insertados en el plásmido pET32a (pET32a/CogiTx1_R y pET32a/CogiTX1_S) y expresadas en células SHuffle de E. coli como proteínas de fusión Trx-TEV-CogiTX1_R/S. CogiTx1_S y CogiTx1_R son péptidos bien plegados de 4970 y 5190 Da, y ambas moléculas presentan la secuencia esperada. CogiTx1_S inhibe subtilisina, elastasa pancreatica porcina, proteinasa K y la proteasa 1 de S. maltophilia (rStmPr1). Sin embargo CogiTx1_R no ea activo frente a ninguna de estas enzimas, resultado que puede deberse a la presencia se dos residuos de aminoacidos -GR extra en el C-terminal cuando se compara con CogiTx1_S. En conclusión, la expresión en E. coli de dos variantes se CogiTx1 fue exitosa y loa resultados obtenidos sugieren que la modificación de la proteína natural es importante para la actividad de CogiTx1.

Abstract

CogiTx1 is a defensin-like subtilisin inhibitor isolated from the sea anemone C. gigantea and its in-depth functional characterization needs to be completed. Since the purification from the natural source has a very low yield, a source of pure and well-folded protein is needed. Therefore, the aim of this work was to obtain two recombinant variants of CogiTx1. To achieve this goal, the sequence of CogiTx1 variants, optimized for expression in Escherichia coli, including a TEV protease site, were inserted in the plasmid pET32Aa (pET32a/CogiTx1_R and pET32a/CogiTX1_S) and expressed in SHuffle E. coli cells as fusion proteins Trx-TEV-CogiTX1_R/S. CogiTx1_S and CogiTx1_R are well-folded peptides with 4970 and 5190 Da respectively and both molecules present the expected amino acid sequence. CogiTx1_S is active against subtilisin, porcine pancreatic elastase, proteinase K and Stenothophomonas maltophilia protease 1 (rStmPr1). However, CogiTx1_R is not active against any of the enzymes evaluated, result that could be due to the presence of two extra residues –GR at the C-terminal when compared with CogiTx1_S (sequence of the natural protein). In conclusion, the expression in E. coli of CogiTx1 variants was successful and the results suggest that the modification observed in the natural protein is important for the activity of CogiTx1