VIII International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences

VIII Conference "Chemical Sciences"

Obtaining and evaluating ternary complexes with a sticholysin conjugate, a polycationic peptide and a DNA plasmid to promote endolysosomal escape of genetic material

Abstract

Non-viral gene transfer is a method used to introduce nucleic acids into higher cells for research purposes, and especially for gene therapy. These have the advantage of being less immunogenic than viral ones and have a lower production cost. A major disadvantage lies in its limited ability to escape the endolysosomal machinery, which causes DNA degradation and consequently reduces the efficacy of the procedure. In this work was evaluated, the ability to control the pore-forming activity of a Sticholisin I mutant, through its conjugation with a 16-lysine polypeptide and the generation of ternary DNA/conjugate/peptide complexes capable of promoting endosomal escape and effective gene transfer. It was demonstrated by native electrophoresis of basic proteins and the hemolytic activity assay that the conjugation yield was and the functional activity of the conjugate can be conditioned to the existence of a reducing environment. By electrophoretic mobility change assay and DLS, it was demonstrated that it is possible to generate complexes with nanometric dimensions by incubating plasmid DNA in the presence of the polypeptide mixture. Both the DNA and the conjugate are efficiently internalized by the cell; however, despite the system has been able to permeabilize the endosome, no expression of the GFP reporter gene was evident.

Resumen

La transferencia no viral de genes es un método utilizado para introducir ácidos nucleicos en células superiores con fines investigativos, y en especial para terapia génica. Estos tienen la ventaja de ser menos inmunogénicos que los virales y poseer menor costo de producción. Una desventaja importante radica en su capacidad limitada para escapar de la maquinaria endolisosomal, lo que provoca la degradación del ADN y en consecuencia reduce la eficacia del procedimiento. En este trabajo se evaluó la capacidad de controlar la actividad formadora de poros de un mutante de Sticholisina I, mediante su conjugación con un polipéptido de 16 lisinas y la generación de complejos ternarios ADN/conjugado/péptido capaces de promover el escape endosomal y la transferencia efectiva de genes. Se demostró mediante electroforesis nativa de proteínas básicas y el ensayo de la actividad hemolítica, que el rendimiento de la reacción fue elevado y que la actividad funcional del conjugado se puede condicionar a la existencia de un ambiente reductor. Mediante ensayo del cambio de la movilidad electroforética y DLS se demostró que es posible generar complejos con dimensiones nanométricas al incubar ADN plasmídico en presencia de la mezcla de polipéptidos. Tanto el ADN como el conjugado son eficientemente internalizados por la célula, sin embargo, a pesar de que el sistema es capaz de permeabilizar el endosoma, no se evidenció expresión del gen reportero GFP.