En vista del alto costo de las celulasas, se propone la obtención y uso de crudos enzimáticos celulolíticos producidos a partir de microorganismos nativos de Ecuador, para ser empleados en el proceso de hidrólisis enzimática de bagazo de caña de azúcar, con el fin de hacer competitiva la producción de etanol de segunda generación. Para este fin se evaluaron microorganismos mediante estudios microbiológicos, bioquímicos y moleculares y se seleccionó un grupo de especies nativas de Ecuador. Se aplicó para el estudio la combinación de los diseños de Plackett-Bürman y Box-Hunter. Una cepa de Bacillus subtilis fue la que ofreció el mejor rendimiento de glucosa (11,96 g/100 g de bagazo). Se propuso el esquema tecnológico y se dimensionó la instalación a partir de los resultados de la cinética del microorganismo. Para mejorar el rendimiento de glucosa obtenido se propuso un estudio de mezclas, en el que se determinó que el empleo de la mezcla de la enzima comercial celulasa (SIGMA) con el crudo enzimático de B. subtilis (Bal3) produjo mejores resultados (15,6 g / 100 g de bagazo). Se realizaron estudios de cinética enzimática de la mezcla, su optimización y reciclaje. Se obtuvo que la nueva mezcla enzimática (63,5% enzima comercial con 36,5% de crudo enzimático de la bacteria nativa), puede ser empleada en la hidrólisis y reciclaje en una industria de producción de 500 HL de etanol de segunda generación.