10th International Scientific Conference on Agricultural Development and Sustainability

10th Symposium of Agronomy

Genetic engineering of Digitalis purpurea L. for in vitro cardenolide production

Abstract

Cardenolides, like digoxin and digitoxin, are extensively applied to treat congestive heart failure. Moreover, cardenolides have been reported to have antiviral activity, a strong cytostatic effect against several kinds of tumors, and a beneficial impact on cystic fibrosis. In this work were presented new insights into the Digitalis genus studies. New methodologies were established for the site-specific excision of selectable marker genes and the selection of transgenic events. Cardenolide biosynthesis was modified in transgenic lines expressing the VEP1 gene. Direct shoot regeneration from leaf segments was achieved with an average number of shoots per leaf segment of 18.9. Moreover, the genetic stability of regenerated plants and secondary metabolite production was confirmed. Shoot regeneration from calli was increased by heat shock between 40 and 42°C. It was possible to obtain marker-free transgenic D. purpurea plants using a heat-inducible Cre/lox recombination system. The hpt/hygromycin B selective system allowed to perform a highly efficient positive selection of transgenic events during callus induction and proliferation. Two selection strategies were developed for the genetic transformation of D. purpurea using the hpt and codA genes. Cardenolide production was enhanced in transgenic D. purpurea by expressing progesterone-5ß-reductase from Arabidopsis thaliana. An efficient in vitro propagation protocol via direct organogenesis was developed to propagate elite lines without affecting their genetic identity and cardenolide accumulation.

Resumen

Los cardenólidos, como la digoxina y la digitoxina, son utilizados en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca. Además, presentan actividad antiviral, un marcado efecto citostático frente a diferentes tipos de tumores y efectos beneficiosos sobre la fibrosis cística. En este trabajo se realizaron estudios novedosos en el género Digitalis. Se establecieron metodologías para la eliminación de los genes marcadores de selección y la selección de eventos transgénicos. Se modificó la síntesis de cardenólidos en plantas transgénicas que expresan el gen VEP1. Fue posible regenerar 18,9 brotes por segmento de hoja vía organogénesis directa. También se confirmó la estabilidad genética y producción de metabolitos secundarios de las plantas regeneradas. La regeneración de plantas a partir de callos se potenció luego de la aplicación de un golpe térmico a 40 y 42°C. Fue posible obtener plantas libre marcadores de selección empleando el sistema de recombinación Cre/lox inducido por golpe térmico. El sistema de selección hpt/higromicina B permitió realizar la selección positiva de eventos transgénicos durante la formación y proliferación de callos con una alta eficiencia. Se desarrollaron dos estrategias de selección para la transformación de D. purpurea con los genes hpt y codA. Se potenció la producción de cardenólidos en plantas transgénicas mediante la expresión de la progesterona-5ß-reductasa de Arabidopsis thaliana. Se desarrolló un protocolo rápido y eficiente para la propagación in vitro de plantas vía organogénesis directa. Este protocolo puede ser usado para propagar líneas élites sin afectar su estabilidad genética y la acumulación de cardenólidos.