Simposio Internacional de Ciencias Farmaceúticas

SICF

Developing capture process of rRBD(319-541) using anion exchanger as negative chromatography

Abstract

Problem to deal with: Culture broth of mammalian cell contains phenol red and more than eighty components with high ionic strength. Due to this complex composition, it is difficult for an anion exchanger to act as negative capture during purification.
Aims: To proof anion exchange as negative capture for recombinant RBD purification.
Methodology: The proposed purification scheme was ultrafiltration/diafiltration, anion exchange, sephadex G-25 and size exclusion chromatography. Two anion exchanger runs were performed to proof the viability of negative capture. Additional experiment was performed with other initial diafiltration for increasing ionic strength. Screening of pH, ionic strength and buffer capacity of the equilibrium buffer were evaluated. The best equilibrium condition was scaled up to evaluate recovery and physical-chemical properties of RBD compared with RBD obtained by control process (Immobilized metal ion affinity capture).
Results and Discussion: High purity RBD is detected in non-adsorbed fraction of anion exchange capture. This confirms that anion exchange acts as a negative capture in the RBD purification. Increase of ionic strength during diafiltration step reduce the binding capacity of the RBD to the matrix. The best equilibrium conditions were: pH 7.5-8.5, 50 mM Tris, 60 mM NaCl. Buffering capacity and ionic strength influenced on concentration of RBD in non-adsorbed fraction. Recovery and physical-chemical properties of RBD were guaranteed regardless of the negative or positive capture.
Conclusions: Anion exchange is a good negative capture for RBD purification. Management of the competition for matrix binding between contaminants and RBD could determine a negative or positive capture.

Resumen

Problemática: El caldo de cultivo de células de mamíferos contiene rojo fenol y más de ochenta componentes con elevada fuerza iónica. Esto dificulta que un intercambiador aniónico actúe como captura negativa.
Objetivo(s): Desarrollar un paso de intercambio aniónico como captura negativa para la purificación de rRBD(319-541).
Metodología: El esquema de purificación propuesto fue ultrafiltración/diafiltración, intercambio aniónico, sephadex G-25 y exclusión por tamaño. Se realizaron corridas de intercambio aniónico para probar la viabilidad de la captura negativa. Se evaluó pH, fuerza iónica y capacidad tampón de la solución de equilibrio. La mejor condición se escaló para evaluar recobrado y propiedades físico-químicas de la RBD comparándola con la obtenida mediante el proceso control (captura por afinidad de iones metálicos inmovilizados).
Resultados y discusión: El aumento de la fuerza iónica durante la diafiltración reduce la capacidad de unión a la matriz. Las mejores condiciones de equilibrio fueron: pH 7,5-8,5, Tris 50 mM, NaCl 60 mM. La capacidad tampón y la fuerza iónica influyen en la concentración de RBD en la fracción no adsorbida. El RBD de alta pureza se detectó en la fracción no adsorbida. Esto confirma que el intercambiador aniónico actúa como captura negativa. Se garantiza el recobrado y las propiedades físico-químicas independientemente de ser obtenida por captura negativa o positiva.
Conclusiones: Adecuando las condiciones de entrada del sobrenadante a la columna, el intercambio de aniones como captura negativa en la purificación de RBD permite obtener la proteína en la fracción no adsorbida con un buen recobrado y una alta pureza.