Problemática: Varios estudios de caracterización estructural mediante espectrometría de masas demostraron que el antígeno de la vacuna CIMAvax-EGF® está compuesto por 13 especies moleculares. Sin embargo, no se ha logrado la separación y cuantificación de cada una de estas especies. Objetivo: En este trabajo se evaluó el efecto de varios parámetros que influyen en la cromatografía líquida de alta resolución por fase reversa (HPLC-FR) para lograr una correcta separación de las especies moleculares. Metodología: Se empleó el método para la determinación de pureza de la materia prima de rhEGF mediante HPLC-FR y se modificaron los factores gradiente, columna cromatográfica, concentración del apareador/supresor de iones en las fases móviles, así como el aumento de la temperatura del horno. Antes de probar un aumento en la temperatura del horno se evaluó la termoestabilidad de las muestras empleadas sometiéndolas a diferentes temperaturas. Para evaluar el efecto provocado por este estrés se determinó la pureza de las muestras tratadas. Resultados y discusión: Las muestras sometidas a altas temperaturas no se afectaron estructuralmente. El método cromatográfico escogido permitió la separación de los picos de rhEGF libre que no se conjugaron durante el proceso productivo. La modificación de los parámetros de corrida evaluados no mostró cambios significativos en el perfil obtenido, ya que ninguno influyó en la resolución del pico correspondiente a las especies conjugadas. Conclusiones: En base a las características estructurales de las proteínas que conforman el antígeno de la vacuna CIMAvax-EGF® han de diseñarse métodos que permitan la separación de sus especies moleculares.