VIII International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences

VIII Conference "Chemical Sciences"

Multiplex RT-PCR for mutational approach in SARS-CoV-2 variants identification.

Abstract

Introduction: Emerging variants of a new coronavirus (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2, SARS-CoV-2) have a significant impact on its transmissibility and pathogenicity, as well as on its diagnosis and vaccine efficacy . This is why monitoring circulating variants is useful in the epidemiological study of the disease. To identify characteristic mutations in SARS variants, a method was evaluated to simultaneously identify eight mutations corresponding to several lines of the virus.
Methods. Complete SARS-CoV-2 genome available in the GISAID and GenBank databases was used to develop mutant-specific probes and primers that selectively amplify carrier samples to be use in a multiplex RT-PCR assay. Analytical performance of the developed assay was measured in order to determine sensitivity, reproducibility and clinical and analytical specificity.
Results: Two mixtures, M1: (ORF1a∆3675/3677(FAM) + S241/243del (HEX) + S∆69/70(CAL) D614G (Cy5)) and M2 (S∆156/157(FAM) + 214ins (HEX)) + V1176F (CAL) + L452R (Cy5)) were designed with mutations corresponding to eleven circulating virus lines and confirmed by sequencing. The multiplex real-time RT-PCR assay was standardized in terms of primer and probe concentration, assay buffer, and amplification schedule. Obtained clinical sensitivity was 97.62 % and analytical sensitivity (Limit of detection) was 5.7log10 IU/mL of WHO’s International Standard. No cross reactivity was shown after evaluation with NATtrol respiratory panel 2 (ZeptoMetrix) consisting in 32 pathogens.
Conclusions: Standardized mixtures specifically identify Alpha, Beta, Gamma, Delta, P2, and Omicron variants, and detect Epsilon, Kappa, Eta, Iota, and Lambda lineages. Developed assays presents a proper analytical performance.

Resumen

Introducción: Las variantes emergentes del nuevo coronavirus SARS-CoV-2 tienen un impacto significativo en su transmisibilidad y patogenicidad, así como el diagnóstico y la eficacia de vacuna. Su seguimiento es útil para el estudio epidemiológico de la enfermedad.
Métodos. El genoma completo del SARS-CoV-2 disponible en las bases de datos GISAID y GenBank permitió desarrollar sondas y cebadores específicos de las mutaciones que amplifican selectivamente las muestras de los portadores mediante la detección simultánea de ocho mutaciones y utilizarlos en un ensayo de RT-PCR multiplex. Se midió el rendimiento analítico del ensayo desarrollado para determinar la sensibilidad, la reproducibilidad y la especificidad clínica y analítica.
Resultados: Dos mezclas, M1: (ORF1a∆3675/3677(FAM) + S241/243del (HEX) + S∆69/70(CAL) D614G (Cy5)) y M2 (S∆156/157(FAM) + 214ins (HEX)) + V1176F (CAL) + L452R (Cy5)) se diseñaron con mutaciones correspondientes a once líneas de virus circulantes y se confirmaron mediante secuenciación. El ensayo multiplex de RT-PCR en tiempo real se estandarizó en términos de concentración de cebadores y sondas, tampón de ensayo y programa de amplificación. La sensibilidad clínica obtenida fue del 97,62% y la sensibilidad analítica (límite de detección) fue de 5,7log10 UI/mL del estándar internacional de la OMS. No se demostró reactividad cruzada tras la evaluación con el panel respiratorio NATtrol 2 (ZeptoMetrix) compuesto por 32 patógenos.
Conclusiones: Las mezclas estandarizadas identifican específicamente las variantes Alfa, Beta, Gamma, Delta, P2 y Omicron, y detectan los linajes Epsilon, Kappa, Eta, Iota y Lambda. Los ensayos desarrollados presentan un rendimiento analítico adecuado.