VIII International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences

VIII Conference "Chemical Sciences"

Performance of an assay for Apolipoprotein E genotyping useful in late-onset Alzheimer's disease and other non-transmissible diseases.

Abstract

Introduction: Apolipoprotein E (ApoE) is a 299 amino acid protein, essential in the regulation of lipid metabolism, acts as a ligand for hepatic receptors and is involved in glucose and cholesterol homeostasis. The APOE gene has two polymorphisms that give rise to six genotypes with different functionality and impact. Genotyping in late-onset Alzheimer's disease identifies the most predisposed individuals. In addition, it can guide diagnosis, risk assessment, prevention and treatment in Parkinson's disease, vascular dementia, prostate cancer, atherosclerosis, multiple sclerosis, type 2 diabetes mellitus, coronary heart disease, type III hyperlipoproteinemia and cerebrovascular disease.
Methods: Allele-specific primers were designed for each allele. DNA was extracted from dried blood on filter paper using Chelex-100 resin. Allele-specific real-time PCR and high-resolution melting analysis (HRMA) were performed. Analytical performance of the developed assay was measured in order to determine reproducibility and clinical and analytical specificity.
Results: An assay was designed and standardized to selectively amplify DNA fragments corresponding to the three alleles of the APOE gene by allele-specific PCR. The assay showed 100% concordance with a commercial reference kit and the results for the three allelic variants were accurate and reproducible, with between-day and between-run coefficients of variation less than 0.4%.
Conclusions: The three standardized allele-specific primer mixtures designed for the detection of the three allelic variants of the APOE gene proved to be specific in the recognition of the sequences of interest and allowed an easy and inexpensive way to determine the genotype of each individual.

Resumen

Introducción: La apolipoproteína E (ApoE) es una proteína de 299 aminoácidos, esencial en la regulación del metabolismo de los lípidos, actúa como ligando para los receptores hepáticos e interviene en la homeostasis de la glucosa y el colesterol. El gen APOE presenta dos polimorfismos que dan lugar a seis genotipos con diferente funcionalidad. La determinación del genotipo en la enfermedad de Alzheimer de inicio tardío permite identificar a los individuos más predispuestos, puede orientar el diagnóstico, la evaluación del riesgo, la prevención y el tratamiento en la enfermedad de Parkinson, demencia vascular, cáncer de próstata, aterosclerosis, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo-2, cardiopatía coronaria, hiperlipoproteinemia tipo III y enfermedad cerebrovascular.
Métodos: Se diseñaron cebadores específicos para cada alelo. El ADN se extrajo de sangre seca en papel de filtro utilizando resina Chelex-100. Se realizó PCR en tiempo real para cada alelo y análisis de fusión de alta resolución (HRMA). Se midió el rendimiento analítico del ensayo desarrollado para determinar reproducibilidad y especificidad clínica y analítica.
Resultados: Se diseñó y estandarizó un ensayo para amplificar fragmentos de ADN correspondientes a los tres alelos del gen APOE mediante PCR alelo-específica. Mostró una concordancia del 100% con un kit comercial, con precisión y reproducibilidad, coeficientes de variación intra e interensayo inferiores al 0,4%.
Conclusiones: Las tres mezclas estandarizadas para la detección de las tres variantes alélicas del gen APOE demostraron ser específicas en el reconocimiento de las secuencias de interés y permitieron una forma fácil y económica de determinar el genotipo de cada individuo.