VIII International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences

SICF

VIII Symposium "Design, Obtaining and Development of Drugs"

Validation of the reverse phase chromatography technique for the identification of the

Abstract

Context: The GHRP-6 peptide is the growth hormone-releasing peptide, which improves the quality of fish larvae and increases defenses against pathogens. The peptide formulation consists of a finished product in powder form, intended for the veterinary application by oral route included in the diet and by immersion route. The reverse phase chromatography is established method for the identification of the GHRP-6 peptide in the Formulation of Acuabio V. Objectives: To validate the parameters for the identification method. Methods: The validated parameters were: System Suitability, Specificity, Linearity, Identification Limit, Precision and Robustness. Results: In the System Suitability Test, it was obtained: Resolution R 2.3 > 2, Asymmetry Factor T 1.490< 2 and Theoretical plates N 34 381> 2000.The method turned out to be selective for the peptide (TR ≈20.6 min) and the placebo (TR ≥ 23.7 min).It was confirmed by ESI-MS mass spectrometry that the main signal 872.44 Da corresponded with the expected molecular mass 872.42± 0.02 Da. The acid hydrolysis study originated new fractions associated with degradations in the peptide. The system complied with the requirements of linearity of calibration curve in the working range (40-2.5 µg R2 0.98) and the identification limit 0.04 µg. The method turned out to be precise: repeatability (CV≤ 1%) y intermediate precision (CV≤ 2%). The technique showed to be robust against all variations studied in the trial (P values 0.73 > 0.05). Conclusions: Validation was satisfactory and the method was adequate for the control and release of the product

Resumen

El péptido GHRP-6 es el péptido liberador de la hormona de crecimiento, el cual mejora la calidad de las larvas de peces y aumenta las defensas contra agentes patógenos. La formulación del péptido consiste en un producto terminado en forma de polvo, destinado a la aplicación veterinaria por vía oral incluido en la dieta y por vía de inmersión. El método establecido para la identificación del péptido GHRP-6 en el Formulado de Acuabio V es la cromatografía en fase reversa RP-HPLC. En este trabajo se describen los parámetros validados para el método analítico: Idoneidad del sistema, Especificidad, Linealidad, Límite de Detección, Precisión y Robustez. En el ensayo de adecuación del sistema se obtuvo (Resolución R 2,3 > 2), (Factor de Asimetría T 1,490< 2) y (No. Platos Teóricos N 34 381> 2000). El método resultó ser selectivo para el péptido (TR 20,6 min) y el placebo (TR ≥ 23,7 min). Se corroboró por espectrometría de masa ESI-MS, que la señal principal 872.44 Da correspondió con la masa molecular esperada 872.42± 0.02 Da. El estudio de hidrólisis acida originó nuevas fracciones asociadas a degradaciones en el péptido. La linealidad del sistema (entre 60- 20 µg R2 0,98) y el límite de identificación 0,02 µg. El método resultó ser preciso intraensayo (CV≤ 1%) e interensayo (CV≤ 2%). La técnica evidenció ser robusta ante las variaciones de las variables en el ensayo (valores P 0,73 > 0.05). La validación fue satisfactoria y el método fue adecuado para el control y liberación del producto.