VIII International Symposium on Chemistry and Pharmaceutical Sciences
SIIQ
XIII Conference "Chemical Engineering: Development, potentials and challenges"
Abstract
The aim of this work is to develop bacterial lipopolysaccharide (LPS) preparations for future use in cancer vaccine development and immunotherapy. First, we developed masters and working banks of three Escherichia coli mutant strains (XL1-Blue, W3110 and LE392), after which we assessed the purity of the cells by Gram staining, cell viability by counting colony forming units (CFU), and identity by growth on plates containing indicator media. All cell banks exhibited microbiological parameters (e.g., high cell viability ranging from 108 to 109 CFU/ml) that met the quality specifications required for a bacterial bank. Also, cell homogeneity and the strain phenotypes were verified. Next, we isolated LPS from Escherichia coli cultures by the hot phenol extraction method and precipitation with absolute ethanol, yielding LPS molecules in a wide range of dry weights (2-21 mg). Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by silver staining always revealed LPS of the rough-type for the three Escherichia coli strains. Protein impurities in the LPS preparations were below the detection limit for Coomassie blue R-250 staining on SDS-PAGE gels. These LPS preparations were biochemically active and showed endotoxic activities ranging from 5.31x106 to 7.46x107 EU/mL in the Limulus Amebocyte Lysate assay. We conclude that our LPS preparations meet the requirements for further experimentation and use in cancer drug delivery.
Resumen
El objetivo de este trabajo es desarrollar preparaciones de lipopolisacáridos (LPS) para uso futuro en el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Primero, desarrollamos maestros y bancos de trabajo de tres cepas mutantes de Escherichia coli (XL1-Blue, W3110 y LE392), después evaluamos la pureza de las células mediante tinción de Gram, la viabilidad celular mediante el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) y la identidad por crecimiento en placas que contienen medios indicadores. Todos los bancos de células exhibieron parámetros microbiológicos (p. ej., alta viabilidad celular que oscilaba entre 108 y 109 CFU/ml) que cumplían con las especificaciones de calidad requeridas para un banco bacteriano. A continuación, aislamos LPS de cultivos de Escherichia coli mediante el método de extracción con fenol caliente y precipitación con etanol absoluto, lo que produjo moléculas de LPS en una amplia gama de pesos secos (2-21 mg). La electroforesis SDS-PAGE seguida de tinción con plata siempre reveló LPS de tipo rugoso para las tres cepas de Escherichia coli. Las impurezas de proteínas en las preparaciones de LPS estaban por debajo del límite de detección para la tinción con azul de Coomassie R-250 en geles SDS-PAGE. Estas preparaciones de LPS eran bioquímicamente activas y mostraban actividades endotóxicas que oscilaban entre 5,31x106 y 7,46x107 UE/mL en el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus. Concluimos que nuestras preparaciones de LPS cumplen con los requisitos para una mayor experimentación y uso en la administración de fármacos contra el cáncer.
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Rafael Antonio Pérez Yanes
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